非典型肺炎的病原学诊断

樊慧珍，女，硕士研究生；主攻方向：肺部感染。黄文杰，博士，主任医师，硕士生导师，本刊特邀审稿专家。型的病原学诊断樊慧珍黄文杰广州军区广州总医院呼吸科（广州510010）型（atypicalpneumonias）一词是在1938年由reimann首次提出，20世纪60年代中期，型主要是指肺炎。随后由于其他肺炎病原体的发现，尤其是衣原体的出现，人们对它又有了新的认识。目前非典型肺炎主要是指一组有类似的不同于典型性肺炎临床表现及放射影像学特征，并对抗生素（主要是大环内酯类和四环素类）有效的肺炎。但国际上对其病原体尚无统一认识。广义上说，它包括细菌以外的所有病原体如支原体、衣原体、立克次体、柯克斯体、军团菌、土拉杆菌、钩端螺旋体、真菌和各种病毒引起的肺炎。《fishman肺脏病学》中非典型肺炎的病原体主要是肺炎支原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、立克次体。中华医学会呼吸病分会1999年制定的《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》［1］中将由肺炎支原体、肺炎衣原体、军团杆菌引起的肺炎称为非典型肺炎。非典型肺炎病原体大多在细胞内寄生，无细胞壁，临床表现无特异性，很难分离培养，血清抗体滴度虽然迅速，但结果不可*。双份血清标本检测至少需要1周以上，目前临床上对该病常依*经验性诊断和治疗。由于缺乏特异的诊断方法，往往延误治疗，以致造成严重的后果。人们一直在寻找快速、有效、可*的诊断方法，本文对近年来非典型肺炎的病原学诊断进展作一阐述。1肺炎目前已发现8种支原体，引起肺炎的主要是肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae），它是介于细菌和病毒之间能独立生活的最小微生物。据统计［2］，有15%～20%的肺炎是由肺炎支原体引起，它也是引起成人社区获得性肺炎最常见的非典型病原体［3］。感染后主要表现为呼吸道症状，x线多表现为，影像学无特殊改变［4］。从临床标本如痰、咽拭子中分离培养出肺炎支原体可确诊，但培养需要3周时间，且阳性率较低。目前临床上常采用血清学检查，但传统的红细胞冷凝集试验敏感性和特异性不高，通过酶联免疫吸附试验、补体结合试验、免疫荧光试验、间接血凝试验等方法测定血清中的特异性抗体也有助于诊断，但部分患者血清中的igm抗体产生较晚，不利于早期诊断。免疫印迹法和免疫荧光法检测肺炎支原体抗原其敏感性不够高。pcr技术和核酸杂交技术的出现为肺炎支原体的诊断提供了一条新途径。waring等［5］利用肺炎支原体特异的p1黏合素基因设计引物，通过pcr扩增其特异产物诊断肺炎。pcr和培养法分别检测280份标本，培养阳性者22份，pcr阳性者73份，培养为阳性的标本pcr均为阳性，阳性患者经过3～6周的抗生素治疗后，3份标本培养阳性而8份标本pcr为阳性。pcr敏感度为90%以上，特异度为100%。luneberg等［6］以编码肺炎支原体延伸因子的基因（tuf）为靶基因设计引物，肺炎支原体可扩增出一950bp的特异片段，扩增产物与肺炎支原体特异的寡核苷酸探针杂交，其敏感性可增加10倍。上述方法用于检测102例呼吸道感染患者的咽拭子标本，21份培养阳性的标本中有19份pcr为阳性（敏感度90%），19份血清学阳性而培养阴性的标本中14份杂交为阳性，62例血清学和培养均为阴性的标本中60份pcr和杂交为阴性（特异度97%）。因此采用pcr和杂交方法可以提高检测的敏感性和特异性。2衣原体属包括肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、衣原体和牛衣原体，其中可引起非典型肺炎的是肺炎衣原体（chlamydiapneumoniae）和鹦鹉热衣原体（chlamydiapsittaci）。它们是严格细胞内寄生的病原体，肺炎衣原体主要寄生在人类的呼吸道中，而鹦鹉热衣原体主要寄生在鹦鹉和其他禽类的组织和血液中。据统计［7］，肺炎衣原体是引起社区获得性肺炎最常见的3种病原体之一，感染率6%～25%，尤其好发于老年男性。有人认为它也是引起儿童和成人哮喘的病因之一，60%以上的患者血清中有特异的肺炎衣原体抗体，其临床症状、体征、实验室检查和预后与肺炎支原体肺炎类似［8］。从鼻咽分泌物、支气管吸出物和肺泡灌洗液等标本中分离培养出衣原体是其诊断的金标准，但衣原体的培养要求条件高，临床标本作细胞培养不易分离到衣原体，而且所需时间长，临床应用受限。目前国际上最常采用的血清学诊断方法是微量免疫荧光试验（mif），通过mif检测到特异的igg≥1∶512，igm≥1∶32或双份血清抗体滴度升高4倍以上均有助于诊断。但部分患者由于早期曾经感染衣原体而引起血中igg抗体持续升高，或由于衣原体与巴尔通体存在交*反应常导致结果不可*，据统计［9］，70%的呼吸道感染患者血清中存在衣原体特异的igg抗体，因此血清学检查并不能确诊。pcr和核酸杂交可弥补上述方法的不足。tondella等［10］针对肺炎衣原体ompa基因特异的vd2和vd4区域分别设计引物和探针，通过实时荧光pcr检测肺炎衣原体感染，肺炎衣原体可扩增出108bp和125bp的特异片段，而鹦鹉热衣原体、衣原体和其他病原体dna未见扩增。该方法和培养法同时检测179份咽拭子标本，vd4阳性者6份（33%），培养阳性者4份（22%），vd2阳性者3份（17%）。tong等［11］利用多重pcr同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体，合成上述3种病原体的特异引物和探针后，利用多重pcr扩增53份呼吸道标本，扩增产物再与种特异性探针杂交，其中11份肺炎支原体标本中9份pcr和杂交为阳性，11份肺炎衣原体标本均为阳性，7份鹦鹉热衣原体标本中6份阳性，其余24份阴性标本两种方法诊断结果一致。以上实验说明分子生物学方法敏感性和特异性高，可用于的早期诊断和流行病学研究。3军团菌肺炎军团菌属至今已发现43个菌种，65个血清型，引起非典型肺炎的主要是嗜肺军团菌（legionellapneumophila，lp），其次是米克戴德军团菌（l.lmicdadei），在严重的社区获得性肺炎的病原体中，嗜肺军团菌位居第二［12］。军团菌肺炎在非典型肺炎中是病情最重的一种，未经有效治疗者病死率高达45%。军团菌肺炎的临床表现和x线均无特异性，很难与其他肺炎区别，诊断主要依*病原学和血清学检查。将痰液、支气管肺泡灌洗液等标本接种于活性炭酵母浸膏培养基（byce）中，若培养出军团杆菌可确诊。但军团菌生长条件要求严格，培养阳性率很低，且所需时间较长。用免疫学方法检测尿液中lp1的特异抗原，敏感性和特异性高，而且检测迅速，但它仅限于测定lp1抗原，阴性结果不能否定诊断，也不能作为疗效考核指标。间接免疫荧光法（ifa）检测血清中特异性抗体是目前应用最多的诊断方法，ifa≥1∶128或双份血清抗体滴度升高4倍以上有助于诊断，但其特异性欠佳。pcr和探针杂交技术可提高检测的敏感性和特异性。金建敏等［13］在军团菌中16srrna基因和mip基因区设计了2对特异引物，用于痰和支气管肺泡灌洗液（balf）的检测，15例军团菌肺炎组痰液和balf标本pcr扩增均为阳性，31例普通肺炎患者痰液和balf无扩增，pcr具有较好的敏感性和特异性。weir等［14］采用检测军团菌的pcr和杂交试剂盒、培养、血清学3种方法检测呼吸道标本，16份军团菌培养阳性的标本pcr试剂盒检测也均为阳性，未出现假阴性结果。随后用该试剂盒检测了另外126份标本，其中4份pcr阳性，与培养和血清学结果一致。整个pcr和杂交过程在6h之内可以完成，而培养需要12d，血清效价观察常需2周以上。pcr和杂交在军团菌肺炎的早期诊断方面有重要意义。非典型肺炎是临床上常见的疾病之一，且近年来其发病率有逐步上升趋势，但传统的诊断方法如培养和血清学检查，费时费力，敏感性和特异性低，远远不能满足临床工作的需要。近年来随着分子生物学的发展，尤其是pcr和核酸杂交技术的出现，为早期诊断非典型肺炎的病原体提供了可能，它具有迅速、敏感、特异、操作简便的优点，尽管who目前还未将其列为常规诊断方法，但相信随着该技术的不断完善改进，它具有广阔的应用前景。参考文献1中华医学会呼吸病学分会.社区获得性肺炎诊断和治疗指南（草案）.中华结核和呼吸杂志，1999，22（4）：1992tanjs.roleofatypicalpneumoniapathogensinrespiratorytractinfections.canrespirj，1999，6（suppla）:15a3hammerschlagmr.mycoplasmapneumoniaeinfections.curropininfectdis，2001，14（2）:1814itohi，ishidat，hashimotot，etal.chestradiographofatypicalpneumonia:comparisonamongchlamydiapneumoinaepneumonia，ornithosis，andmycoplasmapneumoniaepneumonia.kansenshogakuzasshi，2000，74（11）:9545waringal，halseta，csizack，etal.developmentofagenomics-basedpcrassayfordetectionofmycoplasmapneumoniaeinalargeoutbreakinnewyorkstate.jclinmicrobiol，2001，39（4）:13856luneberge，jensenjs，froschm.detectionofmycoplasmapneumoniaebypolymerasechainreactionandnonradioactivehybridizationinmicrotiterplates.jclinmicrobiol，1993，31（5）:10887blasif，tarsiap，arosioc，etal.epidemiologyofchlamydiapneumoniae.clinmicrobiolinfect，1998，4（suppl4）:s18miyashitan，fukanoh，okimoton，etal.clinicalpresentationofcommunity-acquiredchlamydiapneumoniaepneumoniainadults.chest，2002，121（6）:17769shiy，xiaxr，songy，etal.assessmentofpolymerasechainreactionandserologyfordetectionofchlamydiapneumoniaeinpatientswithacuterespiratorytractinfection.chinmedj（engl），2002，115（2）:18410tondellamarialc，talkingtondf，hollowaybrianp，etal.developmentandevaluationofreal-timepcr-basedfluoresceneassaysfordetectionofchlamydiapneumoniae.jclinmicrobiol，2002，40（2）:57511tongcy，donnellyc，harveyg，etal.multiplexpolymerasechainreactionforthesimultaneuousdetectionofmycoplasmapneumoniae，chlamydiapneumoniae，andchlamydiapsittaciinrespiratorysamples.jclinpathol，1999，52（4）:25712yamaguchik，tatedak，ishiiy，etal.clinicalanddiagnosticcharacteristicsoflegionellapneumonia.kansenshogakuzasshi，1997，71（8）:63413金建敏，张沪生，邱琼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